Flp-FRT定點(diǎn)整合穩(wěn)定細(xì)胞株
▏ 名詞定義
Flp: Flp(flippase recombination enzyme)重組酶，是從酵母細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的，其基因全長(zhǎng)1272bp，為48kDa大小的、由423個(gè)氨基酸組成的多肽單體蛋白。
FRT: FRT(Flp Recombination Target)是Flp的識(shí)別位點(diǎn)，全長(zhǎng)48bp，由3個(gè)13bp的反向回文序列和8bp的間隔序列共同組成。與間隔序列相鄰的兩個(gè)反向回文序列是Flp重組酶的識(shí)別和結(jié)合區(qū)域，間隔序列是重組發(fā)生的區(qū)域，也決定了整個(gè)序列的方向。
▏ Flp-FRT定點(diǎn)整合系統(tǒng)
Flp-FRT整合系統(tǒng)是一種用于構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的方法，該細(xì)胞系可在宿主細(xì)胞基因組的特定位置表達(dá)目的基因。該系統(tǒng)利用 Flp 重組酶和 FRT（Flp 重組靶位）位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性重組和整合。該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，確保細(xì)胞中蛋白質(zhì)的持續(xù)生產(chǎn)。
▏ 工作原理
1. Flp-FRT細(xì)胞的構(gòu)建： 將 Flp 重組靶位 (FRT) 位點(diǎn)引入宿主細(xì)胞系的基因組中，一般結(jié)構(gòu)是ATG+FRT+抗性基因，根據(jù)母細(xì)胞選擇轉(zhuǎn)染方案，利用抗性篩選，可以得到穩(wěn)定細(xì)胞株。 科佰思考1：一般認(rèn)為這一步的構(gòu)建，F(xiàn)RT會(huì)整合到細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)位置，也就是說為了后續(xù)的重組外源目的基因的表達(dá)，這一步的整合給了外源蛋白過表達(dá)提供了一定的保障。 科佰思考2：作為常規(guī)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方案，宿主細(xì)胞能整合幾個(gè)拷貝進(jìn)去？選擇幾個(gè)拷貝為好？一般而言構(gòu)建Flp-FRT母細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)染后是隨機(jī)整合，也就是會(huì)存在多個(gè)拷貝整合到宿主細(xì)胞的不同染色體位置。整合的越多，未來目的基因重組整合的也多，也就是表達(dá)會(huì)更高，但是反過來未來重組目的基因時(shí)，多個(gè)拷貝的整合效率可能不是100%的，也就是會(huì)出現(xiàn)混合克隆（克隆間表達(dá)高低不一致），有時(shí)針對(duì)不需要表達(dá)很高的目的蛋白，科佰建議選擇1個(gè)拷貝的整合克隆，這樣未來只要經(jīng)過抗性篩選的克隆，從原理上說就是單克隆，省去了有限稀釋做單克隆的過程。 拷貝數(shù)檢測(cè)，可以咨詢我們的dPCR檢測(cè)服務(wù)。 科佰生物內(nèi)部現(xiàn)貨Flp-FRT細(xì)胞 Cell line Host cell line Characteristic Flp-FRT CHO CHO-K1 Adherent Flp-FRT HEK293 HEK293 Adherent Flp-FRT HCT116 HCT116 Adherent Flp-FRT Jurkat Jurkat Suspension 2. 目的基因的整合： 將含有目的基因的表達(dá)載體、含有Flp重組酶的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入第一步中的細(xì)胞。在Flp 重組酶的介導(dǎo)下，宿主基因組中的 FRT 位點(diǎn)與表達(dá)載體中的 FRT 位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組，達(dá)到目的基因整合的目的，在啟動(dòng)子的作用下，穩(wěn)定表達(dá)。 載體一: 過表達(dá)Flp重組酶，無需抗性，無需穩(wěn)定整合 載體二: 含有目的基因，第二種抗性基因篩選標(biāo)記 重組過程： 最終形成： 重組后，可以通過第二種抗性基因來選擇得到陽(yáng)性細(xì)胞，改細(xì)胞對(duì)抗性基因-2耐受，對(duì)抗性基因-1敏感 
具體的整合位置可以咨詢我們的ISS（integration site search）服務(wù)。
▏ Flp-FRT系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)
1 定點(diǎn)整合，不會(huì)隨機(jī)整合穿插到染色體的任意位置； 2 可控拷貝數(shù)，可以通過Flp-FRT細(xì)胞的拷貝數(shù)來控制目的基因的拷貝數(shù)； 3 穩(wěn)定表達(dá)，相對(duì)于隨機(jī)整合，該表達(dá)系統(tǒng)更穩(wěn)定，同時(shí)可以同抗性基因2篩選，用抗性基因1驗(yàn)證； 4 表達(dá)量高，重組酶整合效率高，且整合在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)； 5 實(shí)驗(yàn)周期短，選擇單拷貝的基因組，可以省去有限稀釋制備單克隆的過程。
▏ 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)
科佰生物提供“Flp-FRT定點(diǎn)整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)，利用該系統(tǒng)，我們已經(jīng)成功構(gòu)建超過200株穩(wěn)定細(xì)胞株的模型，有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，歡迎溝通咨詢。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 病毒感染 Flp-FRT系統(tǒng) 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) 基因編輯 脂質(zhì)體 電轉(zhuǎn) 慢病毒 適用細(xì)胞 部分細(xì)胞 幾乎所有細(xì)胞 幾乎所有細(xì)胞 內(nèi)部4種細(xì)胞 幾乎所有細(xì)胞 部分細(xì)胞 轉(zhuǎn)染/感染效率 低 中 高 高 高 低 隨機(jī)整合 是 是 是 否 - 否 生物安全等級(jí) BL1 BL1 BL2 BL1 BL1 BL1 基因裝載能力 - - <4-5k - - - 陽(yáng)性率 低 高 高 高 高 低 周期 基因合成 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 2-3周 病毒包裝 - - 1周 - 混合克隆篩選 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 1-2周 單克隆篩選 >3 周 >3 周 >3 周 可選 可選 >3 周 合計(jì) > 8-10 周 > 8-10 周 >9-11周 5-7 周 5-7 周 > 8-10 周 工作負(fù)荷 高 中 中 低 低 高
