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示蹤細(xì)胞

前言

 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)是藥物研發(fā)和生物醫(yī)學(xué)研究不可或缺的手段，在新藥試驗(yàn)、疾病診斷、藥物與醫(yī)療器械安全性研究等領(lǐng)域被廣泛使用，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可取得真實(shí)可靠的研究數(shù)據(jù)。

活體成像原理

      活體成像技術(shù)方法主要分為生物發(fā)光和熒光兩種：生物發(fā)光技術(shù)主要是用熒光素酶(Luciferase)標(biāo)記細(xì)胞，而熒光技術(shù)是用熒光蛋白(如GFP,RFP等)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：
 生物發(fā)光活體成像是指在小的哺乳動(dòng)物體內(nèi)利用熒光素酶基因表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫牛隗w外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，無自發(fā)光，背景低，不需要光照激發(fā)，它也有不足之處：波長(zhǎng)依賴性的組織穿透能力，血紅蛋白是吸收光子的主要物質(zhì);每次成像前需要給動(dòng)物麻醉和注射熒光素酶(Luciferase)底物，會(huì)增加人力和試劑成本，底物在體內(nèi)的分布與藥代動(dòng)力學(xué)會(huì)影響發(fā)光信號(hào)。常用的熒光素酶底物：

 Name
 D-Luciferin Firefly,free acid  D-熒光素，游離酸
 D-Luciferin Sodium salt  D-熒光素鈉鹽
 D-Luciferin Potassium salt  D-熒光素鉀鹽
 L-Luciferin,potassium salt  L-熒光素鉀鹽
 Fluorescamine  熒光胺
 Coelenterazine  腔腸素

 

熒光活體成像技術(shù)是通過激發(fā)光將細(xì)胞標(biāo)記的熒光基團(tuán)激發(fā)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光?？紤]到不同熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不同，需要成像設(shè)備具備相應(yīng)激發(fā)光源和發(fā)射濾片。該方法對(duì)設(shè)備和試劑要求較低，熒光蛋白可選擇標(biāo)記多種顏色，熒光蛋白穩(wěn)定性強(qiáng)，缺點(diǎn)是靈敏度較低，需要外源光照激發(fā)，非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比和靈敏度遠(yuǎn)低于生物發(fā)光，激發(fā)光對(duì)動(dòng)物有一定影響。

總的來說，現(xiàn)有的活體成像技術(shù)方法各有優(yōu)勢(shì)，在腫瘤相關(guān)的應(yīng)用領(lǐng)域，生物發(fā)光（Luciferase）活體成像技術(shù)的使用更為廣泛，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

示蹤細(xì)胞的構(gòu)建與使用

        活體成像技術(shù)的應(yīng)用過程中，示蹤細(xì)胞選擇和標(biāo)記非常關(guān)鍵，示蹤細(xì)胞構(gòu)建過程如下：

1. 選擇符合實(shí)驗(yàn)需求和成瘤性指標(biāo)的母細(xì)胞，需要采用來源正確，成瘤性良好，傳代次數(shù)較低，狀態(tài)保持良好的細(xì)胞株作為母細(xì)胞；

2. 選擇適合的標(biāo)記蛋白，常用的標(biāo)記蛋白有Firefly Luciferase，GFP，EGFP, RFP, YFP等；

3. 選擇標(biāo)記蛋白表達(dá)載體和基因?qū)敕绞剑ǔＳ寐《痉绞剑?，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株；

4. 示蹤細(xì)胞體外發(fā)光測(cè)試，測(cè)定發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度和細(xì)胞傳代信號(hào)穩(wěn)定性，確保示蹤細(xì)胞在體外和體內(nèi)都能穩(wěn)定高水平表達(dá)標(biāo)記蛋白，以科佰生物A549-Luc細(xì)胞為例：



5. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要通過尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法在動(dòng)物體內(nèi)接種已標(biāo)記的示蹤細(xì)胞。

6. 活體成像：動(dòng)物經(jīng)麻醉（氣麻/針麻）后放入成像暗箱平臺(tái)，開啟照明燈（明場(chǎng)）拍攝背景圖。關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下（暗場(chǎng)）拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異性光子。明場(chǎng)與暗場(chǎng)的背景圖疊加后可以直觀的顯示動(dòng)物體內(nèi)特異光子的部位和強(qiáng)度，完成成像操作。值得注意的是熒光成像需要選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光濾光片，生物發(fā)光則需要成像前注射luciferase底物。
7. 數(shù)據(jù)處理：動(dòng)物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強(qiáng)度標(biāo)尺的成像圖片外，還能計(jì)算分析發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強(qiáng)度的相關(guān)參數(shù)供實(shí)驗(yàn)者參考。

應(yīng)用介紹

 1.長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，并可建立相應(yīng)的動(dòng)物模型進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選。動(dòng)物體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)示例：

2.腫瘤轉(zhuǎn)移：由于活體成像技術(shù)直觀、靈敏度高的特點(diǎn)，成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的重要手段。動(dòng)物體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移示例：

3.基因治療研究：利用標(biāo)識(shí)蛋白基因分別標(biāo)記病毒或細(xì)胞, 觀察標(biāo)記病毒在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞的靶向識(shí)別和特異性殺傷。實(shí)驗(yàn)示例：

4.CAR-T治療研究：利用標(biāo)識(shí)蛋白分別標(biāo)記CAR-T細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞, 觀察CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)分布和擴(kuò)增，評(píng)估對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和特異性殺傷效果。實(shí)驗(yàn)示例：

科佰示蹤細(xì)胞株特點(diǎn)

       1. 優(yōu)質(zhì)母細(xì)胞，具備STR驗(yàn)證數(shù)據(jù)

  2. 高信噪比

  3.體外高穩(wěn)定性


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